全光式生理學(xué)

在基于光遺傳學(xué)的全光式生理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)動(dòng)物的目標(biāo)神經(jīng)元通過視蛋白的激光觸發(fā)而選擇性地受到光刺激。視蛋白是細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)，充當(dāng)光敏離子通道。

通過觀察來自基因編碼鈣指示劑 (GECI)（例如 GCaMP）的熒光強(qiáng)度，可以同時(shí)反映對(duì)與目標(biāo)神經(jīng)元相連的其他神經(jīng)元的觸發(fā)活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)是在模型實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物（例如嚙齒動(dòng)物和斑馬魚）身上進(jìn)行的，這些動(dòng)物的基因已經(jīng)過修改，可表達(dá)視蛋白和 GECI。

在全光式生理學(xué)中，使用多光子光刺激對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行光刺激，以得到單神經(jīng)元的三維分辨率。

神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（例如，在小鼠皮層中）是三維目標(biāo)，因此刺激和 Ca2+ 成像必須通過 3D 識(shí)別執(zhí)行，以實(shí)現(xiàn)單神經(jīng)元靈敏度。雙光子 Ca2+ 成像是一種成熟的監(jiān)視工具，在全部三個(gè)維度上都具有較高的空間分辨率，這可以將諸如相干公司 Discovery 之類的超快激光器與快速共振掃描結(jié)合使用而實(shí)現(xiàn)。在全光式生理學(xué)的早期演示中，這些激光器還被用于雙光子光刺激中去來刺激多達(dá) 10～20 個(gè)神經(jīng)元。

現(xiàn)在，研究人員希望能夠同時(shí)刺激數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)選定的神經(jīng)元，而這需要一種新的光學(xué)方法。

大量神經(jīng)元的雙光子光刺激

解決方案是使用新一代高重復(fù)頻率超快摻鐿放大器（如相干公司 Monaco）的高功率發(fā)出 1035 nm 的光，再結(jié)合使用一個(gè)或兩個(gè)空間光調(diào)制器 （SLM）去做激發(fā)。建立該組合是為了以全息方式創(chuàng)建束腰模式，該束腰分布與要刺激的神經(jīng)元的空間模式相對(duì)應(yīng)。由于高度依賴雙光子過程的峰值功率，因此僅以足夠高的強(qiáng)度照射這些束腰處的神經(jīng)元，就能夠激發(fā)視蛋白表達(dá)。

新一代高重頻超快摻鐿放大器Monaco，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域雙光子光刺激實(shí)驗(yàn)的一些主要研究人員的首選。

為什么研究人員青睞Monaco?

該激光器的平均功率為 40 或 60 W�？紤]到功率分布在許多神經(jīng)元上，并且 SLM 的引入會(huì)降低光學(xué)系統(tǒng)的整體輸出，因此需要這種較高的功率水平才能同時(shí)激發(fā)數(shù)百個(gè)神經(jīng)元。

同樣重要的是，<300 fs 的脈沖寬度可以更大限度地提高峰值功率與平均功率之比。這提高了雙光子光刺激的效率，同時(shí)盡可能降低光損壞風(fēng)險(xiǎn) — 雙光子光刺激效率與峰值功率 x 平均功率保持一定的比例。 

短脈沖持續(xù)時(shí)間與出色的時(shí)間帶寬乘積相結(jié)合，可確保激光帶寬足夠窄，以更大程度地減少來自 SLM 所有區(qū)域的聚焦光束的色像模糊。

激光器的全光纖架構(gòu)使重復(fù)頻率相當(dāng)靈活，實(shí)現(xiàn)了從單脈沖到完整的50MHz，完全填補(bǔ)了鎖模激光器和激光放大器系統(tǒng)之間通常存在的空白。對(duì)于神經(jīng)科學(xué)家來說，這意味著可以使用所有可能的顯微鏡配置（從共振掃描到帶螺旋掃描或時(shí)間聚焦的 SLM）優(yōu)化光刺激。

全光纖架構(gòu)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是緊湊的尺寸，特別是與大容量/光纖混合方法相比。能夠用在光刺激的激光器始終是相關(guān)配套設(shè)備的一部分，該設(shè)置還包括標(biāo)準(zhǔn)成像激光器和采用 SLM 的更復(fù)雜的兩通道顯微鏡。因此，實(shí)驗(yàn)桌面的空間通常很緊張，而 Monaco 占用空間小，可優(yōu)化實(shí)驗(yàn)桌面空間的使用。再者，相干公司持續(xù)開發(fā)新型激光器，致力于優(yōu)化空間使用、自動(dòng)化操作以及集成便利性，以滿足日益復(fù)雜的大腦生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。例如，單波長激光器 Axon-920, 可用于 GCaMP 的 920 nm的成像，其小型化設(shè)計(jì)是 Monaco 的理想升級(jí)。

單波長激光器Axon 920

雙光子光刺激可探測(cè)視覺感知

James Marshel 及其在 Karl Deisseroth 實(shí)驗(yàn)室（加利福尼亞州斯坦福大學(xué)）的同事最近在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了一篇題為《皮質(zhì)層特定的臨界動(dòng)力觸發(fā)知覺》(Cortical layer–specific critical dynamics triggering perception) 的論文，其中證明了這種方法對(duì)多神經(jīng)元光刺激的有效性和價(jià)值[1]。

在這篇論文中，他們研究了一些非�；�本的視覺刺激如何在小鼠視覺皮層的特定方向的特定神經(jīng)元集合中產(chǎn)生活性。他們展示了通過光遺傳學(xué)方式激發(fā)這些神經(jīng)元的關(guān)鍵子集，同樣能促進(jìn)功能相關(guān)神經(jīng)元的廣泛募集。這種募集并不需要特定方向的“Go/No-Go”任務(wù)（即小鼠移向水源），但這些任務(wù)會(huì)增強(qiáng)這種募集。

我們準(zhǔn)備了表達(dá)光遺傳學(xué)致動(dòng)器的小鼠，光遺傳學(xué)致動(dòng)器是一種新發(fā)現(xiàn)的紅移海洋視蛋白，我們將其命名為 ChRmine，它會(huì)引起內(nèi)向（激發(fā)性）光電流。小鼠還體現(xiàn)了 GCaMP6m作為我們?yōu)殁}離子成像選擇的報(bào)告基因。 

至關(guān)重要的是，我們對(duì)離體神經(jīng)元的測(cè)試表明，使用我們的成像參數(shù)，該致動(dòng)器和報(bào)告基因之間沒有明顯的串?dāng)_。——James Marshel

ChRmine 是使用相干公司 Monaco 和專門設(shè)計(jì)的大像素 SLM 在 1035 nm 處通過雙光子吸收激發(fā)的。他們確定，使用 210 µs 螺旋激發(fā)方案，能夠以千赫茲的速度均勻地在主要視覺皮層 (V1) 中的第 2/3 表層的較大體積（1 平方毫米）上實(shí)現(xiàn)整體激發(fā)。

小鼠觀察到漂移的正弦波光柵 [垂直方向 (0°) 或水平方向 (90°)，并且對(duì)比度有變化（2、12、25 或 50％）]，而 Ca2+ 信號(hào)被記錄下來。在每只小鼠身上，識(shí)別了各個(gè)皮層中方向經(jīng)過調(diào)整的集合 [39.9 ± 8.5（均值 ± SD）] 以響應(yīng)這些移動(dòng)的條紋刺激。然后，研究人員使用雙光子光刺激了一組不同的已識(shí)別集合。 

Ca2+ 成像揭示了，在每種情況下，受刺激的神經(jīng)元都在廣泛的 V1 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中募集活性。通過雙光子光刺激募集的神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)模式與通過真實(shí)視覺刺激募集的模式相同。 

而且，實(shí)驗(yàn)表明，僅這種刺激就能夠促使小鼠正確執(zhí)行“Go/No-Go”任務(wù)，這是通過方向特定的（垂直或水平）訓(xùn)練學(xué)習(xí)的（為了學(xué)習(xí)和執(zhí)行任務(wù)，我們采用頭部固定配置對(duì)小鼠進(jìn)行了研究，并使其在浮球上自由跑動(dòng)）。

Marshel 總結(jié)了這項(xiàng)研究的背景：“通過這樣的研究，我們正在最基本的細(xì)胞層面上慢慢闡明，如何在哺乳動(dòng)物的大腦中激發(fā)并維持相應(yīng)的視像。”